Почему болеет картошка

Этот текст о том, почему болеет картошка. И еще - как бактерии научились жить в симбиозе с плодовыми мушками, чтобы портить больше овощей и фруктов. Статью написал для "КШ" молодой ученый, молекулярный биолог Федор Ширшиков, поэтому из нее можно узнать не только про науку, но и про людей, работающих в этой области.

Вместо предисловия

2020 год был насыщен событиями: коронавирус, Конституция, Беларусь… Но мало кто слышал, что 2020-й был объявлен ООН Годом защиты здоровья растений. От кого нужно охранять картофель - наш второй хлеб, - и пойдет речь в статье. Надеемся, эта история вдохновит кого-то из читателей заняться исследованием картофельных болезней. Ну, или хотя бы послушать песню Владимира Высоцкого "Товарищи ученые". Она про науку и картофель. Довольно актуальная.

Глава первая

Выбор темы для диссертации. - В институт приходит коллекция бактерий из гнилых овощей.

Студенческие годы я провел в стенах Казанского федерального университета, выбрав для себя кафедру микробиологии. Затем была аспирантура в Институте биоорганической химии Российской академии наук. Коротко - ИБХ РАН. Если смотреть на здание института с высоты птичьего полета, то оно напоминает двойную спираль ДНК. Таким задумал его наш первый директор, академик Юрий Овчинников, имя которого вместе с именем его учителя Михаила Шемякина носит институт. Архитекторы создали здесь неповторимую атмосферу - когда попадаешь в здание впервые, оно производит глубокое впечатление. Все в институте сделано для удобства исследователей и занятий наукой.

История, о которой я хочу рассказать, началась осенью 2015 года, когда ИБХ РАН начал проект по диагностике бактериальных заболеваний картофеля. До этого я исследовал противоопухолевые рибонуклеазы из бактерий и занимался компьютерным моделированием свойств токсинов из яда скорпионов. Картошка сразу показалась мне более перспективной темой.

Вскоре коллеги-фитопатологи привезли в нашу лабораторию три огромные картонные коробки с чашками Петри, в которых находились штаммы бактерий, выделенные из гнилой картошки и других растений. Наиболее ранний штамм в привезенной коллекции был датирован 1947 годом - выделили его из подгнившей капусты где-то в Подмосковье. Иногда приходилось выделять штаммы прямо из испорченных клубней картофеля. Пахнет такая картошка своеобразно - чем-то селедочным.

Однако далеко не все образцы оказались так называемыми чистыми культурами. В некоторых было несколько разных видов или даже родов. А какие-то штаммы просто не выжили в процессе хранения и многочисленных пересевов. Наш коллектив немало потрудился, чтобы привести эту коллекцию в порядок. Я в это время занимался созданием электронного каталога бактерий, и первая буква моего имени легла в основу сквозной нумерации штаммов (например, первый штамм получил идентификатор F001).

Глава вторая

Симптомы поражения картофеля пектолитическими бактериями: мокрая гниль и черная ножка Фото: Журнал "Кот Шрёдингера" / Из личного архива Фёдора Ширшикова

Черная ножка и мокрая гниль оказываются одной и той же болезнью. - Бактерии собираются за общим столом.

Как и многие, я люблю картошку - жареную, вареную, запеченную в углях или духовке. Но чтобы картофель попал к нам на стол, очень важно, чтобы им не успели подкрепиться микроорганизмы. Поэтому основной задачей по теме моей диссертации стала разработка способа диагностики таких бактериальных болезней картофеля, как черная ножка и мокрая гниль. Из-за них производители теряют до 50% урожая, а иногда и больше.

Эти названия описывают два симптома одного и того же заболевания, которые проявляются в разных условиях. Когда картофель растет в поле, то фитопатогенные бактерии могут проникнуть через корешки в сосудистую систему побега и пораженный стебель почернеет. В этом случае болезнь называют черной ножкой.

Фитопатогены могут быть опасны и в хранилище, куда привозят собранный урожай. Достаточно одного-двух клубней, подгнивших или даже просто зараженных в поле, чтобы несколько тонн картофеля превратились в зловонную жижу. Тогда болезнь называют уже мокрой гнилью.

Картошка нравится бактериям из-за большого количества крахмала и пектиновых веществ, которые служат для них пищей. Чтобы понять, как выглядит пектин, достаточно вспомнить варенье из груш или яблок. Желеобразную консистенцию придают варенью именно пектиновые вещества. Впрочем, микробы не делают вкусных заготовок, а предпочитают перекусить быстро и на месте. За страсть к пектину этих бактерий называют пектинолитическими или пектолитическими.

Попав в сосудистую систему растения, фитопатогены сначала должны убедиться, что они в большинстве. В этом им помогает так называемое чувство кворума. Все почти как у людей: трапеза не начинается, пока вся семья не соберется за столом. Если бактерий достаточно много, они выделяют в сосуды растения целый комплекс специальных белков-ферментов, предназначенных для разрушения растительной клеточной стенки. Грубо говоря, микроскопические зверюшки вскрывают упаковки и приступают к обеду.

Кривые амплификации (вверху) и плавления продуктов LAMP-реакции (внизу), полученные с помощью амплификатора в режиме реального времени. Зелёным цветом показаны сигналы с положи- тельного контроля, а сигналы с ДНК пектолитических бактерий - красным. Когда реакция проходит специфично, то на кривых плавления виден только один пик. Отрицательный контроль сигнала амплификации не дает. Журнал "Кот Шрёдингера" / Из личного архива Фёдора Ширшикова

Глава третья

Противник проникает через границу. - Петлевая изотермическая амплификация быстро обнаруживает врага.

Диагностическая тест-система, которую я разрабатывал, позволяет определять наиболее опасные для картофеля виды бактерий из рода Dickeya. Эти микроорганизмы появились в России примерно в 2009 году - судя по всему, были завезены вместе с импортным семенным материалом. Патогены просто не заметили, поскольку система контроля семян и отечественные ГОСТы сильно отстают от современных достижений фитопатологии и способов диагностики патогенов растений.

После вторжения невидимого врага российский картофель стал больше подвержен вспышкам черной ножки и мокрой гнили. Если у животных и человека быстрое распространение инфекционной болезни называется эпидемией, то в случае растений говорят об эпифитотии.

Особенно страдают от таких болезней растения южных регионов России: некоторые представители рода Dickeya способны выживать при температурах до 39 °C. При такой жаре и относительно высокой влажности бактерии становятся еще более агрессивными. Известны случаи, когда семенной картофель, выращенный в зоне с умеренным климатом и экспортированный в более теплый российский регион, просто не доживал до осени - гнил на корню еще в поле.

Чтобы быстро выявлять угрозу, нужно иметь надежное средство диагностики, способное обнаружить даже малое количество патогенов. Для решения этой задачи был выбран метод петлевой изотермической амплификации (LAMP, от англ. loop-mediated isothermal amplification).

Метод этот придумали японские ученые в 2000 году. Чем-то принцип синтеза ДНК здесь напоминает оригами. Цепочки ДНК в ходе амплификации складываются с помощью ДНК-полимеразы в определенном порядке, образуя характерные одноцепочечные петли. Полимераза при этом работает при постоянной температуре 60-65 °C. Это означает, что достаточно обычного термостата, способного поддерживать такую температуру…

Трехмерная модель мобильного термостата, разработанная по чертежам автора статьи. Такой прибор мог бы работать от портативного аккумулятора или обычной розетки. Его легко можно взять в полевую экспедицию и развернуть там мини-лабораторию. Журнал "Кот Шрёдингера" / Из личного архива Фёдора Ширшикова

Не буду вдаваться в технические детали. Скажу только, что по скорости, чувствительности и специфичности LAMP превосходит классический метод ПЦР, хотя он значительно более трудоемкий с точки зрения разработки и оптимизации тест-системы. Сегодня LAMP считается наиболее близким к идеалу методом мобильной генетической диагностики.

Хочу немного отступить от основной темы рассказа. Сегодня LAMP взяли на вооружение многие диагностические лаборатории, тестирующие людей на коронавирус. До пандемии я участвовал во многих конференциях и конкурсах на получение гранта, и никак мне не удавалось убедить экспертов, что развитие мобильной диагностики на основе метода LAMP может принести хорошую прибыль. Эта тема не прижилась даже в ИБХ РАН. Сегодня про LAMP знают все специалисты в области молекулярной диагностики, а приоритет в разработке диагностикумов* у нескольких коммерческих организаций.

^{*Диагностикум (греч. Diagnōstikos - способный распознавать) - стандартный препарат, используемый в качестве антигена при серологических исследованиях.}

Да и я уже работаю над темой LAMP-диагностики в одном из крупных московских стартапов. Коммерческие организации в плане развития прибыльных проектов более расторопны, чем академия или университеты. Они не боятся* развиваться и привлекать для этого молодых.

^{*Здесь уместно вспомнить слова академика Овчинникова: "Надо браться за такую работу, которая сегодня кажется совершенно нереальной и невыполнимой. Через год это будет то, что надо".}

Когда я начинал работать над диагностикой фитопатогенов, еще не существовало тест-системы на основе LAMP, позволяющей определять в биологических образцах бактерий рода Dickeya. Кроме нас, как мы узнали несколько позже из научных публикаций, подобную тест-систему разрабатывала еще группа исследователей из США. Но, запатентовав праймеры на полгода раньше, мы все-таки оказались первыми в этом негласном соревновании. После получения патента можно было расслабиться - сесть за диссертацию и поехать на дачу сажать картошку. Но все оказалось не так просто.

Глава четвертая

О пользе систематики бактерий. - Обнаружение нового вида.

Повторюсь: исходно я решал задачу, связанную с молекулярной диагностикой фитопатогенов. Но исследование неожиданно повернуло в сторону уточнения систематики бактерий.

Лечение растений почти не отличается от лечения людей. Сначала пациенту-картофелю ставят диагноз, какая именно бактерия вызвала болезнь. После этого назначают лекарство. А в качестве лекарства можно использовать естественных врагов бактерий - вирусов-бактериофагов. Очень часто фаги видоспецифичны, поэтому чрезвычайно важно иметь актуальную и точную классификацию бактерий. Людей, кстати, тоже в некоторых случаях предпочтительнее лечить бактериофагами, чтобы максимально сохранить нормальную микрофлору. Достаточно сдать образец на бактериальный посев, и врач пропишет подходящий фаговый препарат.

Перед тем как запатентовать наш способ диагностики, нужно было убедиться, что он специфичен, то есть выявляет только интересующие патогены. Для этого обычно ставят диагностическую реакцию на ДНК различных бактерий точно известных видов, включая целевой. При участии коллег из Балтийского федерального университета мы секвенировали геномы 11 штаммов из нашей коллекции. Затем был достаточно длительный этап компьютерного анализа геномов наших бактерий. Полученные результаты сначала показались мне странными. Оказалось, что пять штаммов не имеют родственников среди уже известных видов и составляют уникальную группу. Среди этих "неприкаянных" оказался тот самый штамм 1947 года, а также более поздние образцы - 1993 и 2012 годов. Все эти штаммы были российскими.

Чашка Петри с колониями нового вида Pectobacterium versatile на твердой питательной среде. Каждая желтая точка - отдельная колония, выросшая от одной бактериальной клетки примерно за 48 часов. Фото: Журнал "Кот Шрёдингера" / Из личного архива Фёдора Ширшикова

Перепроверив все несколько раз с использованием разных выборок геномов для сравнения, я пришел к единственно возможному выводу: по всей видимости, у нас на руках новый биологический вид! Некоторые исследователи, которые ежедневно секвенируют бактерий из разных источников, утверждают, что новые виды попадаются довольно часто - достаточно зачерпнуть воды из реки, океана или взять кусочек почвы. Но все-таки когда для открытия нового вида можно просто разобраться с тем, что уже выделено и лежит в лаборатории, то стоит постараться и "пожужжать компьютером". Да и потом, приятно оставить память о себе в области исследований, которыми занимаешься, а иначе что я день за днем делаю в институте? Это нормальный результат работы ученого.

Тем не менее далеко не все научные сотрудники готовы решиться и написать в журнал о чем-то новом. На кону их репутация. В какой-то момент ученым приходится брать на себя ответственность за появление нового таксона на древе жизни. Тогда даже ближайшее окружение не всегда оказывает поддержку. Так было и со мной. Часто приходилось спорить и стоять на своем до последнего.

Новый геномовид я назвал Pectobacterium maceratum, что отражает один из симптомов мокрой гнили, при которой наблюдается размягчение тканей клубня картофеля, или мацерация. Сегодня решением Международного комитета по систематике и таксономии бактерий новый вид окончательно утвержден. Он называется Pectobacterium versatile, что означает "разнообразный".

Штаммы этого вида были обнаружены в самых разных уголках планеты с помощью экспериментальных методов и методов биоинформатики. Риск назвать геномы новым видом был полностью оправдан. Моя статья объемом две странички была опубликована в журнале Genome Announcements 12 апреля 2018 года. Совпадение с Днем космонавтики оказалось весьма символичным, потому что к полетам эти бактерии все же имеют некоторое отношение.

Фотография пробирок после проведения LAMP-диагностики в дневном свете (ДС) и ультрафиолетовом спектре (УФ). Буквой N обозначен отрицательный контроль - в этой пробирке есть все компоненты реакции, кроме ДНК. При срабатывании положительного контроля (1), куда специально добавляют ДНК целевого патогена, или обнаружении фитопатогена в биологическом образце (2 и 3) цвет пробирки меняется на насыщенный голубой. Если же в образце будут бактерии других видов (4-9), цвет пробирок останется фиолетовым. Журнал "Кот Шрёдингера" / Из личного архива Фёдора Ширшикова

Глава пятая

Новый вид бактерий и плодовые мушки могут "дружить". - Почему это может быть выгодно обеим сторонам.

Мы разрабатывали способ диагностики бактерий рода Dickeya и нашли в коллекции российских штаммов новый вид. Когда-нибудь ученые и на него сделают диагностикум. Чтобы это получилось, в геноме бактерии нужно найти уникальный участок, характерный только для этого вида - своего рода видовой паспорт.

Иногда важно не только понять, есть ли в биологическом образце какой-то вид бактерии, но и определить, представляет ли он угрозу для растений, животных или человека. Обычно такие свойства тоже кодируются в геноме патогенов, как, например, гены устойчивости к антибиотикам или гены токсинов. Опасность нашего нового вида в том, что значительная часть его штаммов имеет особый ген evf.

Впервые об этом гене сообщила в начале XXI века группа французских ученых. Им удалось выяснить, что этот ген отвечает за взаимодействие бактерий и плодовых мушек - дрозофил. Эти насекомые обычно питаются подгнившими фруктами и овощами, в том числе клубнями картофеля. Бактерии мокрой гнили оказались способны инфицировать, но не убивать мушек на стадии личинок.

Эксперименты показали, что если ген evf пересадить какой-нибудь безобидной бактерии, которая обычно благополучно переваривается в кишечнике дрозофил, то такая модификация позволит бактериальной клетке выжить в пищеварительном тракте насекомого. Получается, бактерии способны оставаться в тесном взаимодействии с летающими насекомыми. Они, если можно так выразиться, научились летать. Вернее, как обычно говорят биологи - приспособились.

На сегодня обнаружено по крайней мере два вида, в которых есть ген evf. И тут нужно свести воедино два факта. Первый состоит в том, что не все штаммы нового вида обладают геном "дружбы" с дрозофилой. Второй - что такой ген есть не только у нового вида. Из этого следует, что ген evf был приобретен с помощью так называемого горизонтального переноса генов. Это особый способ передачи полезных для выживания и распространения генов между бактериями разной степени родства. Такие гены могут кодировать, опять же, гены устойчивости к антибиотикам или гены ферментов, позволяющих использовать в качестве пищи какой-нибудь новый субстрат.

Результатом переноса обычно становится так называемое селективное преимущество штамма: такие бактерии начинают быстрее размножаться и имеют больше шансов получить численное преимущество в своей или чужой экологической нише. Но гены не берутся из воздуха. Скорее всего, ген evf есть у каких-то других бактерий, например у представителей нормальной микрофлоры кишечника насекомых или почвенных микроорганизмов. Таким образом, бактериям выгодно делиться полезными генами друг с другом - это один из важных факторов их быстрой эволюции.

Но если бактерии мокрой гнили могут распространяться летающими насекомыми, недостаточно просто изолировать гнилые клубни от остального урожая или обработать картошку бактериофагами. Бактерии научились использовать мушек как средство транспорта на большие расстояния, а значит, контролировать необходимо и насекомых-переносчиков.

Зачем такое сожительство бактериям, более-менее понятно: им важно быстрее и дальше распространиться. Что же касается плодовых мушек, то, на мой взгляд, они подружились с бактериями, чтобы вместе питаться растительной пищей. Я не исключаю, что бактерии, выделяющие ферменты для усвоения растительных компонентов, могут делать то же самое и в кишечнике дрозофилы, помогая своему крылатому хозяину-сотрапезнику разрушать растительные остатки до простых сахаров. Такие сахара усваиваются намного легче. В качестве ответного жеста плодовая мушка переносит часть бактерий на новый клубень картофеля в соседнее овощехранилище.

Мне кажется, это очень простой и эффективный механизм взаимовыгодного существования бактерии и насекомого. Если вдуматься, примерно так же строятся отношения человека и молочнокислых бактерий, которые присутствуют в молочных продуктах и одновременно составляют значительную часть микрофлоры нашего кишечника.

Пока это просто гипотеза. Может, когда-нибудь я всерьез займусь ее проверкой. А может, буду заниматься совсем другой темой, не менее интересной. Мне кажется очень перспективной область молекулярной диагностики на основе амплификации. Было бы здорово придумать новый метод изотермической амплификации, который был бы прост в плане разработки новых тест-систем и надежен в применении.

Стереоизображение структуры белка, который кодируется геном evf. Рисунок можно рассматривать с помощью специальных стереоскопических очков, однако после небольшой тренировки объёмную структуру удаётся увидеть и невооружённым глазом. Расположите рисунок на расстоянии 20-30 см от глаз, расслабьте глаза так, как будто бы вы смотрите в бесконечность. Из четырёх возникающих изображений два центральных сведите воедино - оно и будет стереоскопическим. Журнал "Кот Шрёдингера" / Из личного архива Фёдора Ширшикова

Заключение

Я не знаю, какие исследования из тех, что я проводил, пригодятся мне в будущем. Например, когда я был студентом, то изучал белковые молекулы методом построения профилей гидрофобности - на том же математическом подходе основаны способы предсказания стоимости акций на фондовых биржах. Потом была стажировка в ИБХ РАН, где я освоил базовые навыки программирования. Спустя несколько лет все это пригодилось мне в аспирантуре для создания программы MorphoCatcher для поиска генов-мишеней при разработке диагностикумов.

Навыки могут пригодиться в любой области, и свежий взгляд на проблему очень много значит для ее решения. Поэтому всем, кто хочет заниматься наукой, можно посоветовать не фокусироваться всю жизнь на одном проекте. Полезно менять темы исследований, иногда кардинально.

В заключение хотелось бы снова процитировать Юрия Анатольевича Овчинникова. Он говорил: "Наукой движет сказанное впервые". Действительно, делать что-то уникальное, чему пока нет аналогов, как-то по-особенному мотивирует, дает силы думать и прорабатывать самые мелкие детали, которые на первый взгляд могут показаться неважными. Однако зачастую именно из таких деталей складывается невероятно красивый научный результат.